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蛋白电泳及Western blot
发表时间:2012-09-14 阅读次数:2322次

 

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
按电泳槽说明书安装玻璃板。
 
表1. 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
2. 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液
 
根据玻璃板凝胶模具的体积确定需配制凝胶的量,再分别配制分离胶和浓缩胶溶液。
将丙烯酰胺溶液灌至两块玻璃板中间的间隙中,给浓缩胶留出足够空间(梳齿长再加1 cm)。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层双蒸水。将凝胶垂直放置于室温下。
待聚合完成(30 min),倒掉覆盖层,将配制好的浓缩胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上,立即在其中插入梳齿,注意不要混入气泡,将凝胶垂直放置于室温下。
配制好的凝胶可在4℃冰箱中放置备用。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离胶和浓缩胶所用溶液的配比见表1、2。
取5 µg重组蛋白,与等体积的2×蛋白上样缓冲液混匀后沸水浴5 min,12, 000 r/min离心5 min,离心后取上清点样到15%的SDS聚丙烯酰胺凝胶,连接电源后电泳,浓缩胶时用8 V/cm电压,待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15 V/cm继续电泳,直到溴酚蓝染料到达分离胶的底部,关掉电源。取出凝胶,装备染色。
 
SDS聚丙烯酰胺凝胶的染色
在90 mL甲醇:水(1:1,v/v)和10 mL冰乙酸的混合液中溶解0.25 g考马斯蓝亮R-250,滤纸过滤以去除颗粒状物质。
用至少5倍体积的染液浸泡凝胶,放在平缓摇动的平台上于室温染色4小时以上。
移出并回收染液以备后用,将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液中,平缓摇动4-8小时,其间应更换脱色液三四次。
 
Western印迹
蛋白电泳分离后用Bio-Rad半干转移仪将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上(5 V 转移过夜)。
转移结束后关掉电源,取出NC膜放入容器(培养皿)中,加适量的封闭缓冲液(含5%(w/v)脱脂奶粉的PBS缓冲液),室温轻轻摇动温育1-2小时。
换新的培养皿,加入10 mL上述封闭缓冲液,并按1:2000的比例加入兔抗CT抗血清,4 °C温育2小时。
PBS缓冲液洗涤三次,每次10 min。
将NC膜转移至另一培养皿中,加适量二抗缓冲液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5),室温洗涤10 min。
倒去缓冲液,加入含有5%脱脂奶粉的上述二抗缓冲液,并以1:5000量加入二抗(碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG),室温摇动温育1小时。
再将NC膜转移至另一培养皿中,加适量二抗缓冲液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5),室温洗涤三次,每次10 min。
加酶联抗体生色底物(10 mL碱性磷酸酶缓冲液,66 µL NBT, 33 µL BCIP,混匀)室温摇动温育。
蛋白带颜色达到要求后,把膜转移到另一培养皿中,加终止液(40 µL 0.5M EDTA,10 mL PBS)终止反应,扫描。
 
 

 

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