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石蜡切片技术
发表时间:2012-09-14 阅读次数:2592次

 

    新鲜的组织件必须马上进行固定,植物组织一般固定于FAA固定液中。由于需要切片必须进行真空抽气。为了尽量不破坏植物组织内的细胞组成及内含物成份,抽气及放气必须缓慢。经过抽气的植物组织会沉入瓶底,并有空气小泡从组织中冒出。
试剂配制
FAA固定液(100ml),室温保存
配制:无水乙醇      50ml     50%
      冰醋酸         5ml      5%
      37%甲醛      10ml     10%
      水            35ml
封片剂:  50%中性树胶+50%二甲苯
poly-lysine:用蒸馏水溶解,浓度为1mg/ml,溶解后于4℃冰箱保存备用
染色剂:0.05% 甲苯胺蓝: 0.05g溶于100g  ddH2O
实验步骤
1.  第一天所需材料适量(不超过固定液体积的1/20)取到已盛有FAA固定液的青霉素小瓶中。用真空泵缓慢抽气(抽气过程10分钟),在真空状态(>20atm)放置15分钟后,缓慢放气(放气过程10分钟)。可观察到有空气小泡冒出,样品沉到瓶底。室温放置16小时(准确)后开始脱水。
    准备工作:将蜡(Paraplast Plus)在60C融解过夜。
2. 第二天早上9:00,脱水。梯度分别为:50%乙醇(植物组织应该沉在瓶底,说明抽气是充分的),50%乙醇,60%乙醇,70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,100%乙醇,100%乙醇,1/4二甲苯:3/4乙醇,1/2二甲苯:1/2乙醇,3/4二甲苯:1/4乙醇(饱和番红),室温下每级30分钟。90%二甲苯:10%氯仿,90%二甲苯:10%氯仿,90%二甲苯:10%氯仿,室温下每级60分钟。最后将90%二甲苯:10%氯仿装满青霉素小瓶体积的一半。(用90%二甲苯10%氯仿的目的是让蜡片浮起;而100%二甲苯中蜡片会沉底,压伤组织)
3.  将3-5片Plus蜡片(Paraplast Plus)小心投入含1/2体积90%二甲苯10%氯仿和样品的小瓶,并将小瓶放置于已调到42C的HEAT BLOCKER上,大约15分钟后蜡溶解,轻轻摇动小瓶,使溶解的石蜡均匀分布,再加入3-5片蜡片。几次后小瓶渐满,保持30分钟后,将材料用镊子迅速转入已放有融好的Plus蜡片(Paraplast Plus)(在60C的HEAT BLOCKER上)的新青霉素小瓶中,过夜。
第三天,第四天,每天换蜡2-3次,每次间隔大于6-10小时。
准备工作:60C预热Regular蜡片(Paraplast Regular)。
5.  第五天,包埋。将熔好的Regular蜡片(Paraplast Regular)倒入带手套折好的小船中,用烧热的镊子将材料夹到小船内,并摆好位置。待表面的蜡稍凝,将小船迅速浸于已备好的冷水中,放置至少2小时。(此过程可在60C的烤片机上进行)。包埋好的蜡块可用干净容器装好置于4C存放。
玻片清洗与处理:
用洗衣粉水浸玻片半天后,用绸布轻轻檫洗,后用清水冲洗一小时左右。
蒸馏水冲洗,凉干玻片凉干后,观察玻片表面是否清洁,清洁玻片用4ul poly-lysine涂片,后放于42℃烘箱中烘过夜 。
6.打开展片机42℃,预热涂有poly-lysine的处理过的载玻片上的水。先大致修块,再精细修块,切片厚度8-10微米。
7.42℃展片10分钟即可。展片后放入45-50℃的烘箱内的玻片架子上,用一次性手套包好,以免污染。烤片24小时以上(时间越长越好)。
8.脱蜡、染色、脱水
100%二甲苯(20min),100%二甲苯(15min),1/2二甲苯1/2乙醇(1-5min),100%乙醇(2min),100%乙醇(2min),95%乙醇(1min),85%乙醇(1min),70%乙醇(1min),50%乙醇(1min),蒸馏水(1min),甲苯胺蓝(1h),70%乙醇(30s),85%乙醇(30s),95%乙醇(30s),100%乙醇(1min),100%乙醇(1-2min),二甲苯(3min),二甲苯(10~30min)
注意:二甲苯和乙醇容易挥发,用一段时间后要更新。
9.封片
从二甲苯中取出载玻片,用适当封片剂滴于玻片上,用盖玻片封片,应注意避免气泡产生。

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