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拟南芥的种植,转化和筛选
发表时间:2012-09-14 阅读次数:3391次

 

1 拟南芥的种植
试剂配制
人工土:3份蛭石,1份珍珠岩和1份黑土混合
PNS营养液
每升含
5ml 1M KNO3,
2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O,
2ml 1M MgSO4˙7H2O,
2.5ml 20mM  Fe.EDTA, 
2.5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5),
1ml MS 微量元素 。
PNS营养液母液配方
①1M    KNO3  101.1g
②1M    Ca(NO3)2˙4H2O    236.15 g
③1M    MgSO4˙7H2O,246.48 g
④20mM  Fe.EDTA:     
FeSO4       5.57g             
EDTA        7.45g
注意先各自配成溶液,在混合。 
⑤1M磷酸缓冲液(pH5.5):
磷酸二氢钾    130.4g 
磷酸氢二钾    9.12g
⑥MS 微量元素 
硼酸                     0.434g 
硫酸锰(MnSO4 H2O)     1.7626g
CuSO4˙H2O                0.0798g 
ZnSO4˙7H2O               0.172g 
NaMoO4˙2H2O             0.0432g 
NaCl                     0.585g 
CoCl˙6H2O                0.00129g 
以上母液均配至1L
种植步骤
将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中,并用保鲜膜罩上。两天后光照,三天后揭膜。
人工培养室条件:相对湿度80%,恒温20-240C,光照强度80-200umol/M2/S,光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。
2 拟南芥的转化
试剂配制
渗透培养基(一升中):1/2xMurashige-Skoog;5% 蔗糖;0.5克 MES;用KOH调至pH5.7;再加:10微升1mg/ml的6-BA 母液;200微升Silwet L-77)
注意:6-BA 母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制,但大量元素减半。
另:经转化的拟南芥,种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子
转化步骤
(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml,在转化前一天晚上,转入大瓶培养过夜,第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。
(2) 室温5000rpm离心15分钟。
(3) 弃上清,将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里,使O.D600在0.8左右。
(4) 将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株(或用抽真空的方法),盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度,移入恒温室避光培养,第二天可开盖,正常光照培养。
(5) 一周后再喷洒一次,方法同上。
3 转化子的筛选
(1) 种子消毒:先用70%乙醇浸泡10分钟,在上述处理时要不时地使种子悬浮;然后用无菌水洗四次,在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。
注意:用乙醇浸泡的时间不宜过长!
(2) 处理后的种子用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。
(3) 4℃春化2到3天,移入22℃恒温室培养。
(4) 观察种子在固体筛选培养基上生长情况,可确定为转化子时,将转化子移栽至浇过饱和PNS营养液的人工土壤培养。
 
 

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