内部访问登录界面
登录密码:
     
常用资料
当前位置:首页 >> 常用资料 >> 实验方法资料
琼脂糖凝胶NORTHERN杂交
发表时间:2012-09-14 阅读次数:1515次

 

试剂配制
除杂交液和洗膜液外,所有试剂都用DEPC水配置,所有器皿都在180℃烘8hr或者在双氧水中泡半小时以上,`所有的离心管和PIPET都用新的。
DEPC水
10XMOPS(pH 7.0)
10XMOPS(pH 8.0)
甲酰胺
甲醛
20XSSC 
杂交液: 7% SDS,1%BSA, 1mM EDTA, 0.25 M NaHPO4 (pH 7.2)
洗膜液: 0.2XSSC,0.2%SDS
实验步骤
1.电泳RNA定量,RNA上样量为5-10mg。
2.倒胶,将胶在水中加热融化后,冷却到60℃后,加入10xMOPS,和3%甲酰胺,混匀倒胶。[1.95g 琼脂糖溶于110ml DEPC水,加热融化,冷却到60°C后加入15ml 10xMOPS(pH 8.0),25ml 甲醛(formaldehyde)。]
3.配电泳缓冲液(1000ml):100ml 10xMOPS(pH 7.0), 800ml DEPC水, 100ml甲醛。
4.配RNA Loading Buffer (1650ml): 200ml 10xMOPS(pH 8.0), 350ml甲醛, 1000ml 甲酰胺,100ml 常用10X Loading Buffer。
5. 样品RNA: RNA Loading Buffer=1:3,混匀, 68℃放置5min, 冰上放置5min,上样。
6.电泳4-5 hr 至溴酚蓝距上样孔孔6cm。电泳时每隔半小时搅动一次电泳液。
7.将胶在水中洗2次,将需要染色的泳道(Marker)切下,EB(0.5mg/ml)染色,拍照。
5.不染色部分直接在10XSSC中转膜,过夜。转膜装置由下往上:玻璃板,盐桥,绝缘垫片,胶,膜,虑纸,吸水纸。
6.将膜表面吸干(无水渍反光),在紫外交联仪上交联, 80℃烘2小时。膜存放于4℃,备用。
7.55℃杂交液中预杂交1-2小时。
8.加入随机引物法标记的同位素探针,65℃杂交过夜。
9.65℃用洗膜液洗膜15分钟,两次。
10.将杂交膜用保鲜膜封好后于-70℃放射自显影,或压磷屏。
11.膜存放于洗膜液中,4℃保存。 

| 网站管理 | 联系我们 | 添加收藏 | 设为首页 |

版权所有 © 上海交通大学植物发育生物研究室 技术支持:维程互联

网站访问量:
track internet traffic